Zellaufschlusssysteme, Lyse, Homogenisation
Als Zellaufschluss bezeichnet man einen Prozess, bei dem biologische Moleküle aus dem Inneren einer Zelle freigesetzt werden. Die Zellinhaltsstoffe (Proteine, Organellen, DNA/RNA, Enzyme, AAV-Vektoren für die Gentherapie) werden z.B. für die Entwicklung von Therapeutika eingesetzt.
Zellen, die ihre Zellinhaltsstoffe nicht selbständig freisetzen, müssen einen Zellaufschlussprozess durchlaufen. Bei der Wahl des Aufschlussverfahrens ist darauf zu achten, dass die Zellinhaltsstoffe möglichst intakt bleiben. Dazu ist eine gute Kontrolle der Temperatur und der eingebrachten Scherraten erforderlich.
Microfluidizer®–Homogenisatoren sind eine ideale Zellaufschlussmethode, weil sie nicht nur selbst widerstandsfähigste Zellwände effektiv aufbrechen können, sondern gleichzeitig die Zellinhaltsstoffe schonen. Ob Bakterien-, Pflanzen-, Säugetier- oder Hefezellen, Algen oder Pilze – alle sind mit einem Microfluidizer® verarbeitbar. Höchste Proteinausbeuten werden erzielt.
Microfluidizer®–Homogenisatoren bieten viele Vorteile gegenüber anderen Zellaufschlussmethoden- sowohl für Anwendungen im Labor als auch für die Produktion.
Zellaufschluss mit den höchsten Proteinausbeuten
Hefezellaufschluss (S.pombe)
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Vor Verarbeitung |
Nach Verarbeitung |
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Hefezellaufschluss (S. Pombe) vor und nach der Verarbeitung in einem Microfluidizer®, 5 Durchläufe, ca. 95% Aufschlussgrad.
Vorteile der Microfluidizer®-Technologie für den Zellaufschluss
Höchste Proteinausbeuten
Exakt kontrollierbare Scherraten erlauben Microfluidics-Kunden, den gewünschten Zellaufschlussgrad mit geringst möglichen Drücken zu erreichen und dadurch Proteine zu schonen. Im Vergleich mit anderen Aufschlussmethoden erzielt der Microfluidizer®-Hochdruckhomogenisator höhere Proteinausbeuten und -aktivitätslevel, wie in verschiedenen Publikationen nachzulesen ist.
Effiziente Kühlung
Viele Zellinhaltsstoffe sind temperaturempfindlich, weshalb eine gute Kühlung nach dem Aufschluss sehr wichtig ist. Im Microfluidizer®-Prozess durchläuft das Lysat sofort nach dem Aufschluss eine effiziente Kühlung, so dass ein prozessbedingter Temperaturanstieg minimiert und Denaturierung ausgeschlossen wird.
Benutzerfreundlichkeit
Ausgangspunkt bei der Entwicklung der Microfluidizer® war es, eine hohe Produktivität und einfache Homogenisation zu gewährleisten – daher sind die Maschinen einfach zu bedienen und zu reinigen. Kunden sind sehr zufrieden mit der Wartungsarmut der Microfluidizer®-Maschinen, insbesondere im Vergleich mit Ventilhomogenisatoren, und der einfachen Reinigung ohne Kreuzkontamination.
Vereinfachte Downstream-Prozesse
Durch den schonenden und doch effizienten Aufschluss mit der Microfluidizer®-Technologie werden relativ große Zellwandfragmente erzeugt. Diese sind leichter abzutrennen als kleinere Partikel, wodurch die an den Aufschluss anschließende Filtration oder Zentrifugation vereinfacht wird.
Scherung von DNA ist ebenfalls möglich, wenn gewünscht, und erlaubt das einfache und akkurate Pipettieren von kleinen Lysatvolumina
Verarbeitung bei kontrollierbarer, konstanter Scherrate
Verarbeitung bei konstantem Druck und konstanten Scherraten gewährleistet, dass alle Zellen den gleichen Energieeintrag erfahren und somit gleich aufgeschlossen werden, unabhängig von der Probenmenge und von Tag zu Tag bzw. Probe zu Probe reproduzierbar. Bei anderen Verfahren, wie beispielsweise beim Aufschluss mittels Ultraschalls, ist der Energieeintrag deutlich weniger homogen und es kommt zu sehr hohen lokalen Temperaturanstiegen, die die Ausbeute beeinträchtigen. Mit der Microfluidizer®-Technologie können sogar scherempfindliche Materialien wie Säugerzellen zur Gewinnung von AAV (Adeno-associated Virus)-Vektoren erfolgreich verarbeitet werden.
Kontaminationsfreiheit
Da der Microfluidizer®-Prozess ohne Mahlkörper auskommt und extrem verschleißarm ist, ist die Verunreinigung der Proben mit Fremdmaterial vernachlässigbar.
Garantierte Skalierbarkeit
Bei vielen anderen Verfahren ein Problem, ist der Scale-up bei Microfluidics garantiert. Gleichförmige Verarbeitung im Labor und in der Produktion sind einer der vielen Gründe, warum Kunden auf die Microfluidizer®-Technologie schwören.
Flexibilität
Durch Anpassbarkeit von Druck und Scherraten und optimierter Kühlung erlaubt der Microfluidizer® die Verarbeitung der unterschiedlichsten Zellarten.
Geringe erforderliche Mindestprobenmengen
Mit dem Microfluidizer® LV1 können Probenmengen bereits ab 1 ml verarbeitet werden.
Vorteile im Labor
Labor-Microfluidizer® schließen Zellsuspensionen schnell (bis zu mehreren hundert ml/min) und effizient auf. Sie sind variabel einsetzbar und können selbst kleine Probenmengen (ab 14 ml, beim LV1 ab 1 ml) verarbeiten.
Vorteile in der Produktion
Die einfache und lineare Skalierbarkeit bei Microfluidics ist für die Prozessentwicklung sehr wichtig. Während bei anderen Aufschlussverfahren die Übertragbarkeit vom Labor in die Produktion (und umgekehrt) oft Probleme aufwirft, ist diese mit der Microfluidizer®-Technologie garantiert.
Zellaufschlussverfahren - ein Überblick
Vorteile der Microfluidizer®-Technologie im Vergleich mit anderen Aufschlussverfahren:
| Microfluidizer | Homogenisator | Ultraschall | Kugelmühle | |
|---|---|---|---|---|
| Kontinuierlich | Ja | Ja | Nein | Nein |
| Skalierbar | Ja | eingeschränkt | Nein | Ja |
| Temperaturkontrolle | Ja | Ja | Nein | Nein |
| Kontaminationsfreiheit | Ja | Ja | Ja | Nein |
| Mindestvolumen | 1ml | 10ml | 1ml | 1ml |
| Konstante Scherrate | Yes | No | No | No |
Beim Vergleich verschiedener Zellaufschlussverfahren schneidet die Microfluidizer®-Technologie besonders gut ab. Gefrier-Tau-Zyklen und Aufschluss im Mörser sind für kleine Mengen an Zellsuspension akzeptabel, aber nicht sehr reproduzierbar oder skalierbar.
Chemische Lyse hat den Nachteil, dass die benötigten Chemikalien teuer sind und Umweltprobleme mit sich bringen können.
Mahlen in einer Kugelmühle o.ä. kann ein effizientes Aufschlussverfahren sein, allerdings mit dem Nachteil der Produktkontamination durch Mahlkörperabrieb.
Beim Ultraschallaufschluss werden Kavitationskräfte eingesetzt, um die Zellwände aufzubrechen. Diese Methode wird oft für Kleinstmengen verwendet, bringt aber Probleme hinsichtlich lokaler Überhitzung und Skalierung mit sich.
Die früher verbreiteten French Press-Systeme verlieren wegen der schwierigen Handhabung und schlechter Reproduzierbar- und Skalierbarkeit zunehmend an Bedeutung.
Hochdruckhomogenisatoren bieten, nach dem Microfluidizer®, eine gute Möglichkeit des Zellaufschlusses: Preislich in etwa vergleichbar, allerdings oft mit Nachteilen hinsichtlich Kühlung, Verschleiß und Skalierbarkeit.
Microfluidics International Corporation, Hersteller des Microfluidizer® Processors, ist führend in Entwicklung und Produktion von Labor-, Pilot- und Produktionsmaschinen für Mikro- und Nanotechnologieanwendungen zum Einsatz in der Biotechnologie, Chemie, der pharmazeutischen Industrie sowie anderen Industriezweigen.
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